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本制品是一种基于WST-8的显色反应，利用吸光度检测，简单、快速、灵敏地筛选或检测谷氨酰胺酶抑制剂的试剂盒。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选的自动化操作系统。本试剂盒中的谷氨酰胺酶来源于微生物，如有需要可以自行使用人源或其它适当来源的谷氨酰胺酶进行替代。

选择性抑制谷氨酰胺酶已成为一种靶向癌症代谢的重要治疗策略。作为一类作用于代谢枢纽的新型疗法，谷氨酰胺酶抑制剂不仅展现出良好的抗癌潜力，其应用领域也已扩展至代谢紊乱、神经系统疾病、免疫调节及器官移植等多个重大疾病范畴，为复杂临床问题提供了新的解决思路。目前，已知的GLS抑制剂包括L-DON、JHU-083、IACS-6274等，其中L-DON (6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸)不仅展现出良好的抗癌活性，还具有抗菌和抗病毒活性。尽管现有的GLS抑制剂疗效显著，但部分癌细胞仍可能产生耐药性。因此，开发兼具高效药理活性与理想药代动力学特性的新型谷氨酰胺酶抑制剂，将在未来疾病治疗中发挥重要作用。

在谷氨酰胺酶(GLS)的作用下，谷氨酰胺(Glutamine)水解生成谷氨酸(Glutamate)，谷氨酸在谷氨酸脱氢酶(GDH)的催化下生成ɑ-酮戊二酸(α-KG)，在这一反应过程中NAD⁺被还原为NADH；生成的NADH在电子耦合试剂的作用下将WST-8还原生成橙黄色的Formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中Formazan的生成量与样品中谷氨酰胺酶的活性成正比。如果在反应体系中加入GLS抑制剂，Formazan的生成就会受到抑制。吸光度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出抑制剂的抑制效果。

本试剂盒检测灵敏性好，而且特异性强。本试剂盒中提供了微生物来源的谷氨酰胺酶(Glutaminase)、谷氨酰胺酶底物(Substrate A)、阳性对照谷氨酰胺酶抑制剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(L-DON)，并且对谷氨酰胺酶和底物的使用量进行了优化，不仅能检测出IC50较低的抑制剂，也能检测出IC50较高的抑制剂。

• 本试剂盒中的谷氨酰胺酶来源于微生物，虽然已知的广谱的、非物种特异性的谷氨酰胺酶抑制剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(L-DON)也可有效抑制本试剂盒中的谷氨酰胺酶，但通过本试剂盒筛选得到的抑制剂，对于人谷氨酰胺酶的具体抑制效果还需要进一步的验证。
  
• Assay Buffer A、Assay Buffer B、Substrate A、Substrate B和L-DON (10mM)需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它试剂使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。
  
• Substrate B从-20℃拿出在融解过程中可能会有析出，平衡至室温后析出的部分会溶解，不会对检测结果产生影响。
  
• 本试剂盒中体积较小的试剂使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。
  
• 待测抑制剂样品的溶剂可能会对检测产生干扰，推荐使用本试剂盒提供的Assay Buffer A作为溶剂用于配制、稀释样品。如果样品必须用其它试剂配制、稀释，请进行一定的测试，并在对照孔中添加与样品等体积的溶剂以排除干扰。

• 样品(待测抑制剂)的准备：取适量待测抑制剂样品，用Assay Buffer A等适当的溶剂配制成适宜浓度的溶液，如果有必要可以配制成适当的浓度梯度待用。
  
• 试剂盒的准备：
  
  • 将Assay Buffer A、Assay Buffer B、Substrate A、Substrate B和L-DON (10mM)等试剂平衡至室温后分别混匀备用。其它试剂使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。
    
  • Glutaminase (1×)的配制。按照每个抑制剂样品需5μL Glutaminase (1×)的比例配制适量的Glutaminase (1×)。取适量的Glutaminase (10×)，按照1:9的比例用Assay Buffer A稀释。例如10μL Glutaminase (10×)加入90μL Assay Buffer A配制成100μL Glutaminase (1×)。Glutaminase (1×)可在冰上暂时保存，1小时内酶活性基本稳定，但建议尽量现配现用。
    
    所有涉及酶的操作应在冰上进行。
    
    
  • GLS反应工作液的配制。按照每个抑制剂样品需50μL GLS反应工作液的比例配制适量的GLS反应工作液。均匀混合44μL Assay Buffer B、2μL Substrate B、2μL WST-8、2μL Enzyme Solution B，即可配制成50μL GLS反应工作液。根据待检测样品(包括标准品)数量，配制适量GLS反应工作液。具体配制方法参考下表。GLS反应工作液须现配现用。
    

    成分(μL)	样品数
    	1	10	20	50
    Assay Buffer B	44	440	880	2200
    Substrate B	2	20	40	100
    WST-8	2	20	40	100
    Enzyme Solution B	2	20	40	100
    GLS反应工作液	50	500	1000	2500

    GLS反应工作液宜现用现配。配制好的GLS反应工作液在储存过程中可能会引起背景值升高，进而影响检测效果。GLS反应工作液的配制也可以在步骤4b孵育过程中再进行，即配即用。
• 抑制剂阳性对照的准备：本试剂盒提供的阳性对照抑制剂L-DON浓度为10mM，配制在超纯水中。用户可以根据需要使用与待测抑制剂一样的溶剂稀释成所需浓度梯度，例如稀释成5、10、20、50、100、200、500μM等浓度，取5μL用于检测。通常L-DON的IC50约为1～10μM，使用本试剂盒检测L-DON的抑制效果参考图2。
  
• 抑制剂样品的测定：
  
  • 参考下表设置各组别反应体系，并按照下表依次加入各检测试剂和抑制剂样品。加入待测样品后，混匀，37℃孵育10分钟。
    
    部分抑制剂对GLS活性的抑制可能具有时间依赖性，待测抑制剂样品加入后在37℃孵育时间的长短可能会影响IC₅₀值，建议通过预实验确定待测抑制剂比较适合的孵育时间。为获得更加可靠的检测结果，建议每个样品设置2～3个平行孔。
    
    

    Reagent	Blank Control	100% Activity Control	Positive Control	Sample
    Assay Buffer A	40μL	35μL	35μL	35μL
    Glutaminase (1×)	-	5μL	5μL	5μL
    L-DON	-	-	5μL	-
    Sample Solvent	5μL	5μL	-	-
    Inhibitor Sample	-	-	-	5μL

    • Sample Solvent是指配制和稀释待测抑制剂所用的溶剂。如果特定的溶剂对于检测体系的干扰比较大，可以减少溶剂和待测抑制剂样品的用量至1～3μL，同时相应地增加Assay Buffer A的用量。
      
    • 请参考步骤3进行阳性对照抑制剂L-DON的配制。
  • 各孔快速加入5μL Substrate A工作液，混匀，37℃孵育10分钟。
    
  • 各孔快速加入50μL GLS反应工作液，混匀。
    
    GLS反应工作液加入后反应会立即开始，在孔数较多的情况下，建议在低温或使用排枪操作以减小各孔间加入GLS反应工作液的时间差而导致的误差，混匀操作可在微孔板振荡器上进行。
    
    
  • 37℃避光孵育10分钟，测定A450。当完全活性对照(100% Activity Control)吸光度值偏低时，也可适当延长孵育时间至15至20分钟。
    
    • 如果用于测定的酶标仪能够进行动力学读数，可将仪器温度提前设定并升温至37℃，GLS反应工作液加入并混匀后立即放入酶标仪进行测定。建议将测定总时间设为10分钟，对应的测定间隔时间设为1分钟或2分钟。
      
    • 抑制剂的抑制效果可能会随着孵育时间的延长或缩短存在一些波动，最佳孵育时间可以自行摸索调整。
• 计算方法：
  
  • 取所有组别中检测数据中前期一段时间内呈现线性的数据用于分析和计算。计算各组在单位时间内的吸光度值变化，可分别记录为ΔA450_Sample、ΔA450_{Blank Control}、ΔA450_{100% Activity Control}和ΔA450_{Positive Control}。例如所有组别在时间点t1和t2时间范围内呈现良好的线性变化，那么所有组别均计算出A450_t2－A450_t1即为该组别的ΔA450。
    
  • 计算每个样品的抑制百分率。计算公式如下：
    

    抑制率(%)＝	ΔA450100% Activity Control－ΔA450Sample	×100%
    	ΔA450100% Activity Control－ΔA450Blank Control

  • 对于检测发现有效的抑制剂，通过检测该抑制剂的剂量效应就可以计算出该抑制剂的IC50。使用本试剂盒检测L-DON对于谷氨酰胺酶的抑制作用的检测结果请参考图2。

本试剂盒提供的L-DON是一种不可逆的谷氨酰胺酶抑制剂，通常L-DON的IC50约为1～10μM，本试剂盒对L-DON的检测效果如图2所示，IC₅₀约为4.8μM。